近期，我校生物工程学院穆晓清教授团队在基于空间位阻效应的酶工程定向改造策略方面取得重要进展，研究成果“Reshaping Substrate-Binding Pocket of Leucine Dehydrogenase for Bidirectionally Accessing Structurally Diverse Substrates”正式发表于ACS Catalysis(IF = 13.7) (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.2c04735)。
基于空间位阻效应修饰的底物结合口袋重塑已成为酶-底物接受度进化的有效策略。然而，以往的研究集中在利用空间位阻减轻诱变（如丙氨酸，甘氨酸扫描）来解锁酶口袋难以容纳的非天然大底物的接受度。与大底物相比，空间尺寸小的底物能较容易的进入酶口袋，但其催化活性通常低于其天然底物甚至无底物特异性。目前，空间位阻影响小底物结合的调控规律及其与影响大底物结合之间分子机制差异尚不明晰，导致在蛋白质工程中设计和实施基于空间位阻修饰的口袋重塑以用于结构多样性底物（小、天然、大）的接受度进化仍然具有挑战性。
本研究以源于Exiguobacterium sibiricum的亮氨酸脱氢酶（EsLeuDH）为模型催化剂，选择空间尺寸规则增加的1a−i为模型底物。活性分析发现，EsLeuDH对天然底物1e具有最高的活性，但对短链脂肪族的1a−d和长链芳香族的1f−i活性不佳或无底物特异性。底物尺寸和催化活性之间的相关性促使研究人员探索通过基于空间位阻修饰的双向口袋重塑来提高EsLeuDH的底物接受度。预测具有双向空间位阻可调性的关键突变位点是双向重塑的关键步骤之一。为此，研究人员解析了EsLeuDH的蛋白结构，并结合分子对接、结构分析和序列保守性分析等手段筛选出了6个突变位点（L49、M74、A122、T143、V300、V303）进行口袋重塑。基于空间位阻指标的诱变文库设计是双向重塑的另一个关键步骤。为了最直观地反映底物接受度的变化是由空间位阻的变化所引起，研究人员制定了系列目标诱变残基的筛选原则，最后选择了6种疏水性氨基酸（W、F、L、V、A、G）作为目标诱变残基。随后构建了基于空间位阻修饰的定点双向诱变文库。活性分析发现，在加强和减轻空间位阻的两个诱变方向上，除底物1i外，所有测试的底物1a-h都获得了优势突变株，此结果证明了理性设计的双向诱变文库的有效性。此外，通过对不同诱变方向上单点优势突变株进行组合突变，进一步提高了底物1a-h的催化活性。基于结构的计算分析表明，在减轻位阻方向上，以底物1h为例，EsLeuDH原始的底物结合口袋无法容纳1h侧链苯环。而突变体V303G和V303G/L49G导致了明显的构象重排，并伴随着不同程度的口袋扩张，实现了1h的催化活性构象结合；在加强空间位阻方向上，以底物1c为例，其主链羰基与EsLeuDH催化残基K89间的攻击距离明显大于天然底物1e。而突变体T143L和T143L/V303L促进了1c主链羰基对催化残基K89的空间可及性，缩短了攻击距离并增强了底物稳定性，使得1c呈现出更具催化活性的构象。
该研究以EsLeuDH为模型催化剂，通过在单个突变位点设计和实施基于空间位阻修饰的双向口袋重塑，解析了酶口袋空间位阻影响小底物接受度的调控规律并阐明了空间位阻影响小底物和大底物接受度之间分子机制的差异，在氨基酸脱氢酶家族成员和其他具有类似底物结合口袋的氧化还原酶的多样性底物接受度进化中具有潜在的应用前景。
图形摘要
穆晓清教授和聂尧教授为论文的通讯作者，我校2020级博士生吴涛为第一作者。上述研究得到了国家重点研发计划（2021YFC2100100）、国家自然科学基金（21336009、21176103）等资助。
近年来穆晓清教授团队在高效辅酶依赖型氧化还原酶的创制及高附加值手性产物的绿色制备方面取得丰硕成果，相关研究成果已发表在ACS Catalysis (2022)、Metabolic Engineering (2021)、Biotechnology for Biofuels (2021)、Frontiers in Bioengineering and Biotechnology (2022)、ChemCatChem (2021)、Applied Microbiology and Biotechnology (2021)、Bioresources and Bioprocessing (2022)等本领域权威期刊。
