近日，我校粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心邓禹教授团队在精氨酸脱羧酶适碱性改造及其丁二胺生物合成方面取得重要进展，研究成果“Rationally Engineering pH Adaptation of Acid-Induced Arginine Decarboxylase fromEscherichia colito Alkaline Environments to Efficiently Biosynthesize Putrescine”正式发表于国际权威期刊Advanced Science(IF=15.1)(https://doi.org/10.1002/advs.202307779)。
蛋白质同源寡聚是自然进化过程中形成的一种常见蛋白质特性，约一半的蛋白质以同源寡聚体形式存在。寡聚结构的稳定对蛋白质的功能活性和稳定性有重要影响，然而，在实际应用中，存在寡聚蛋白质的实际催化环境不利于其寡聚结构形成的情况。碱性丁二胺的关键合成酶——酸诱导型精氨酸脱羧酶AdiA是一种典型的十聚体同源寡聚蛋白，其活性结构为由五个二聚体组成具有中心对称结构的双层五元环。每个二聚体中由于单体交叉互扣形成了两个中心对称的活性口袋和底物通道，但单独的二聚体结构松散，只有形成双层环状十聚体时，才能较好地催化精氨酸脱羧。由于AdiA表面有大量酸性氨基酸，其十聚体结构仅在酸性环境下（pH＜6.0）稳定存在，而在中性和碱性条件下，大部分AdiA以二聚体或单体形式存在，加之胍丁胺酶SpeB的最适pH为碱性，使得AdiA与SpeB级联催化合成丁二胺的生产效率受到限制。
丁二胺作为合成耐高温尼龙PA46、PA410、PA4T的前体物质，其生产一直被帝斯曼DSM所垄断。邓禹教授团队为了提高AdiA的适碱性进而提升丁二胺的生物合成效率，提出了一种针对高阶寡聚蛋白的内聚化改造策略：从十聚体的经向界面和纬向界面两个角度出发，利用酸性氨基酸和碱性氨基酸的相互作用，引入静电亲和力，促进AdiA十聚体在碱性环境下寡聚，同时增强纬向界面通道对酸性精氨酸底物的亲和力。基于优势突变体经向界面的E467K和纬向界面的H736E构建组合突变体E467K_H736E（AdiA-M2），其pH 8.0条件下的酶活是野生型AdiA的35倍，并表现出极佳的碱耐受性。基于分子动力学模拟解析，发现467位的赖氨酸取代，明显降低了经向界面处的静电排斥作用，而736位的谷氨酸取代有效提高了通道入口的底物亲和力，并使两单体结合更为紧密。此外，基于结构叠加比对，利用该内聚化策略，有效提高了类似寡聚蛋白赖氨酸脱羧酶CadA的适碱性能力。利用上述最佳适碱性AdiA突变体AdiA-M2，结合丁二胺降解途径的阻断和丁二胺关键合成酶（SpeA和SpeB）的组合表达，工程菌株ΔEGAP-SpeAB-AdiA-M2催化合成128.9 g/L丁二胺，摩尔转化率达到0.94 mol/mol，产率为2.15 g/(L·h)，实现丁二胺的高效合成。
图形摘要
上述研究以我校19级博士研究生王莉和21级硕士研究生丁博为论文的共同第一作者，邓禹教授和李国辉副研究员为论文的共同通讯作者。此研究工作得到了国家重点研发计划（2021YFC2100700）、国家自然科学基金（21877053、22008088）、江苏省杰出青年基金（BK20220089）、江苏省博士后科研基金计划项目（2020Z012）、中国博士后科学基金（2020M681485、2021T140277）以及天津市合成生物技术创新能力提升项目（TSBICIP-KJGG-015）的资助。
