利用组合代谢工程策略改造大肠杆菌从头合成2′-岩藻糖基乳糖

近日，Bioresource Technology在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队刘龙教授课题组的研究成果“Combinatorial metabolic engineering ofEscherichia coliforde novoproduction of 2′-fucosyllactose”（Lin et al., 2022, 351: 126949）。江南大学2018级博士生林璐为论文第一作者，刘龙教授为通讯作者。

2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose,2’-FL）是母乳中含量最高的寡糖(约占31%)，可以维持婴幼儿胃肠道微生物菌群平衡，在婴幼儿的生长发育中起重要作用。目前，微生物发酵法是生产2'-FL的主要方法。目前已报道的2’-FL工程菌株通常含有多个兼容性质粒，在发酵后期容易出现质粒丢失的情况，而且采用多拷贝质粒的T7聚合酶表达系统过表达异源蛋白，在大肠杆菌（E. coli）中容易因蛋白合成速率过快造成蛋白错误折叠而聚集形成大量包涵体，最终影响2’-FL的高效合成。

针对上述问题，研究人员选用GRAS菌株E. coliMG1655作为合成2’-FL的细胞平台，采用CRISPR-Cas9系统将幽门螺杆菌来源的α 1,2-岩藻糖基转移酶基因futC整合至E. coli基因座上，实现FutC的稳定性表达，构建从头合成2’-FL的基因工程菌株；其次，通过增加FutC基因的拷贝数，删除前体GDP-L-岩藻糖和底物乳糖竞争模块中的蛋白酶Lon、十二烷基磷酸葡萄糖磷酸转移酶WcaJ、β-半乳糖苷酶LacZ和阻遏蛋白LacI，2'-FL产量提高到0.8 g/L；然后，通过提高FutC的可溶性表达来改善2'-FL的合成效率。借助蛋白标签的高度可溶性，将五种蛋白标签（MBP、TrxA、NusA、DsbA和SUMO）分别通过(GGGGS)₂柔性Linker连接在FutC的N-末端，发现融合了TrxA标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶TrxA-futC可以有效提高2'-FL的合成，2'-FL产量提高至2.9 g/L；在此基础上，进一步删除谷胱甘肽还原酶Gor，2'-FL产量提高到3.3 g/L；最后，通过控制甘油和乳糖的最低补料速率，有效降低了代谢副产物乙酸的积累，在3-L发酵罐中工程菌株从头合成2'-FL的产量达到10.3 g/L。

上述研究工作得到了国家自然科学基金(31930085, 31870069)、国家重点研发项目(2018YFA0900504、2018YFA0900300)、江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX20181828）项目的资助。

图1 2’-FL在E. coli中的合成途径

图2 不同整合位点对2’-FL从头合成的影响

图3 乳糖操纵子对2'-FL合成的影响

图4 蛋白标签和还原酶缺陷菌株促进2'-FL的合成

图5 比较2'-FL补救途径和从头途径以及3-L罐补料分批发酵

（编辑：潘梦妍）