近日，ACS Synthetic Biology在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队赵鑫锐副研究员课题组的研究成果“Efficient Synthesis of Phycocyanobilin by Combinatorial Metabolic Engineering inEscherichia coli” (Zhao, et al.ACS Synth. Biol.2022, 11, 6, 2089-2097)。江南大学赵鑫锐副研究员为论文第一作者，周景文教授为论文通讯作者，论文作者还包括2017级本科生高海鑫、2020级硕士生王宇琪、2021级硕士生王紫微。
藻蓝素(Phycocyanobilin，PCB)天然存在于蓝藻光感应系统中，在光能的吸收和传递中起着至关重要的作用，在光遗传学的研究中被广泛应用。由于其具有亮丽的天蓝色，可以作为天然色素在食品饮料中呈色，安全健康，营养丰富，是FDA唯一批准的蓝色食品添加剂。PCB还具有抗氧化、消除自由基、修复细胞延缓衰老、保水抗冻的作用，广泛应用于化妆品领域。此外，作为一种安全的药物，口服PCB在体内可以转化为NADPH氧化酶的有效抑制剂，在治疗阿尔茨海默症方面表现出巨大潜力；PCB对冠状病毒主要蛋白酶的活性也具有潜在的抑制作用，有潜力应用于防治近年来爆发的新型冠状病毒肺炎。目前，PCB的获取方法主要采用高温甲醇分解法从螺旋藻中提取。该方法存在诸多问题：(1) 甲醇高温热解需要耗费大量的能量，造成能源浪费；(2) 螺旋藻中与PCB共存的其他色素，如叶绿素、叶黄素等一系列前体，对后期产物纯化有不利影响；(3) 螺旋藻生长周期较长，限制了藻蓝素的生产效率和应用。因此，从天然藻类中提取高纯度的PCB是一项复杂且不经济的方法。
针对此问题，江南大学食品合成生物学与生物制造团队研究人员采用生物法合成PCB，降低成本，节约能源，提高纯度，在5 L发酵罐实现了PCB世界最高水平合成，是PCB能在工业上得到广泛应用的重要前提。首先，通过比较选择了来源于T. elongatus的HO1和来源于Synechocystis sp的PcyA来合成PCB，在此基础上，确定了含有强诱导启动子(T7lac)的高拷贝数质粒(pRSFDuet-1)最适合表达这两种酶(图1，图2)。此外，在中等拷贝数的pCDFDuet-1载体中，采用DNA支架以2:1的比例实现HO1和PcyA的有效组装(图3)。随后，通过直接补充血红素前体ALA和适度过表达血红素生物合成途径中的关键酶(HemB和HemH)，增加细胞内前体物质供应，促进PCB合成。由于催化血红素合成PCB的两步酶促反应都伴随着铁氧还蛋白(Fd)和Fd-NADP+还原酶(Fnr)的循环再生，研究人员通过表达nadK基因(编码 NAD+激酶)来加速辅因子循环，进一步增强了PCB合成(图4)。此外，研究人员还通过添加还原剂作为辅助，发现当培养基中加入维生素C或谷胱甘肽时，藻蓝素产量会得到提高，进一步优化了维生素C的添加量，发现添加5 g/L维生素C时，最适合PCB生产。
最后，分别在摇瓶和发酵罐水平对发酵条件进行优化(图5)。在摇瓶水平，在30℃条件下用0.8 mM IPTG诱导，采用含有200 mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H2O和5 g/L维生素C的MR培养基有利于提高PCB的产量。在发酵罐水平，采用pH-stat法进行补料分批发酵，添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO4·7H2O和200 mg/L FeSO4·7H2O，在发酵罐水平获得藻蓝素28.32 mg/L，是至今报道的最高产量。此研究为在大肠杆菌中合成藻蓝素或血红素衍生物及其他天然色素提供了策略。
上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2021YFC2101400）、国家轻工业技术与工程一流学科（LITE2018-08）、国家自然科学基金（31900067）和中央高校基本科研业务费专项资金（JUSRP52021）等项目的资助。
图1 藻蓝素合成途径
图2 优化HO和PcyA的表达策略以合成藻蓝素
图3 通过DNA支架调节HO和PcyA比例促进藻蓝素合成
图4 增强藻蓝素合成中辅因子循环
图5 在5 L发酵罐中进行分批发酵和补料分批发酵
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/aQECQVWmlsB-MBAQLT9lzA
（编辑：潘梦妍）
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