近日，Advanced Science在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队赵鑫锐副研究员课题组的研究成果“Biosynthesis of high-active hemoproteins by the efficient heme-supplyPichia Pastorischassis” (Yu, et al.Adv. Sci.2023, 2302826,http://doi.org/10.1002/advs.202302826)。江南大学2019级博士生余飞为论文第一作者，赵鑫锐副研究员与堵国成教授为论文通讯作者，论文作者还包括周景文教授、李江华教授、陈坚教授以及泰兴市东圣生物科技有限公司研发总监鲁伟。
血红素类蛋白是包括血红蛋白（Hb）、肌红蛋白（Mb）、细胞色素P450酶、过氧化氢酶与过氧化物酶在内的血红素结合蛋白，在多种细胞生物学功能中发挥着重要作用。目前，这些血红素类蛋白已经应用于食品、医药、高细胞密度发酵以及生物催化剂等领域。其中，猪肌红蛋白（P-Mb）与肉的颜色以及金属风味密切相关；大豆血红蛋白（S-Hb）已作为颜色添加剂用于人造肉的生产；透明颤菌血红蛋白（V-Hb）具有很强的氧气运输能力，常用于代谢工程领域以促进细胞生长和产物合成；来源于巨大芽孢杆菌的P450-BM3单加氧酶可以催化区域选择性和立体选择性羟基化反应，常用作药物（甾体C7醇）、天然产物（苯酚）和化学中间体（环辛酮与氢醌）合成的全细胞生物催化剂。
随着食品工业、高细胞密度发酵以及高附加值化合物的合成对这些血红素类蛋白需求的不断增长，有必要开发一个可以高效合成高生物活性血红素类蛋白的微生物平台。在V-Hb应用于高细胞密度发酵方面，P. Pastoris由于可以在简单且廉价的碳源中生长到高密度（细胞干重达150 g L-1以上），因此相对E. coli和S. cerevisiae更具有优势。因此，美国食品和药物协会（FDA）批准的公认安全（GRAS）的具有强大的表达和分泌能力的P. pastoris菌株是生产血红素类蛋白的理想候选菌株。
目前，除P450-BM3外，尽管其他三种血红素类蛋白（P-Mb、S-Hb与V-Hb）已在P. pastoris中成功表达，但仍有三个瓶颈阻碍这些高活性血红素类蛋白的有效合成。（1）血红素类蛋白中珠蛋白组分的低表达水平以及降解问题。（2）酵母血红素生物合成过程中存在的空间隔离导致的血红素合成与利用效率低下。根据以前的研究和一些网站报道，八种血红素生物合成酶分别分布在S. cerevisiae的细胞质与线粒体中。血红素合成中间体在血红素生物合成过程中必须多次穿过内外线粒体膜，降低了血红素合成和利用的效率。（3）血红素生物合成过程中限速步骤的存在造成的血红素供应不足以及过表达所有血红素生物合成酶引起的血红素合成中间体的大量积累。
针对这些问题，江南大学食品合成生物学与生物制造团队研究人员构建了可合成高活性血红素类蛋白的高效血红素供应P. pastoris底盘菌株。考察不同P. pastoris宿主、基因剂量与发酵时间对血红素类蛋白中珠蛋白成分表达的影响，选择合适的基于甲醇诱导（PAOX1）的表达体系；并通过过表达PAOX1转录激活因子（Mit1、Mxr1与Prm1）与敲除蛋白酶（Yps1-1、Prb1与Pep4），强化珠蛋白的转录以及抑制其降解。在珠蛋白组分有效表达的基础上，对P. pastoris胞内血红素生物合成途径进行改造以提高血红素辅基的供给水平。此研究为P. pastoris中高效合成其他血红素类蛋白如过氧化物酶或过氧化氢酶等提供了可借鉴的策略。
上述研究工作得到了国家重点研发计划（2021YFC2101400）、国家自然科学基金（31900067）和国家轻工业技术与工程一流学科（LITE2018-08）等项目的资助。
相关研究图示
（编辑：潘梦妍）
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