近日，ACS Synthetic Biology以封面文章形式发表了糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的综述论文“Applications of CRISPR in a microbial cell factory: From genome reconstruction to metabolic network reprogramming”(Wu et al., ACS Synth. Biol. 2020. 9(9):2228-2238)。江南大学17级博士生武耀康为论文第一作者，刘龙教授为通讯作者，论文作者还包括刘延峰研究员、吕雪芹助理研究员、李江华教授和堵国成教授。

通过对微生物细胞的代谢网络进行修饰与重构构建细胞工厂，可以实现食品、药品、化学品等各种高附加值产品的绿色可持续生产。合成生物学、系统生物学以及代谢工程等学科领域的诞生与发展大大促进了微生物细胞工厂的“设计-构建-测试-学习”过程。而在众多先进技术中，基于CRISPR (clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)的基因编辑和转录调控工具由于可以解决细胞工厂设计与构建过程中的诸多挑战而受到了人们的关注。本文主要从基因组重构与代谢网络重编程两方面介绍了CRISPR系统在微生物细胞工厂中的应用，并对其将来的发展做出了进一步的展望。

在使用CRISPR对微生物细胞工厂进行基因组重构时，主要利用了引导RNA (gRNA)介导下Cas9和Cpf1等Cas蛋白特异性的DNA识别和切割活力。由于细胞代谢网络的复杂性，多个基因位点的组合修饰对于构建高效的微生物细胞工厂是非常重要的，而在多个gRNA的引导下将Cas蛋白靶向到基因组的不同位点便可以很容易地实现这一目的，因此文中对于如何通过合理设计来表达多个gRNA进行了深入探讨；通过引入基因组规模的修饰改造对微生物细胞进行高通量的优化也是构建细胞工厂时非常有效的一种策略，结合CRISPR技术与DNA芯片能够做到可追踪的基因组规模编辑，这一策略在大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母等模式工业微生物具有非常广泛的应用；此外，由于DNA酶活力失活的Cas蛋白如dCas9和dCpf1仍具有的特异性的DNA识别和结合能力，通过将特定的功能结构域（胞嘧啶脱氨酶、DNA聚合酶或RNA聚合酶等）融合到dCas9和dCpf1上可以得到很多新型的基因编辑工具，这些工具在微生物细胞工厂基因组重构中也有非常广泛的应用。

在利用CRISPR系统对微生物细胞工厂进行代谢网络重编程时，主要借助了dCas9或dCpf1的DNA识别和结合能力来对基因的转录过程进行精准调控。利用dCas9或dCpf1的空间位阻或者通过融合转录抑制蛋白对靶基因的表达进行下调称为CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi），而通过融合转录激活蛋白对靶基因的表达进行上调称为CRISPR激活（CRISPR activation，CRISPRa），这些调控策略目前已被广泛应用于微生物细胞工厂代谢流的重定向；得益于其良好的稳定性与系统特异性，基于CRISPR的转录调控工具也常被用于构建逻辑基因回路，从而实现更为精准和复杂的调控过程；另外通过多种方式将信号感知机制引入到CRISPR系统的调控过程中，还可以实现微生物细胞工厂代谢网络的动态与自发调控。

虽然CRISPR系统在应用过程中仍存在一些问题，例如PAM序列的限制以及脱靶效应，但是这些可以通过对Cas蛋白进行理性或非理性的改造来解决。另外，除了本文中集中讨论的第2类第II型CRISPR-Cas9系统和第2类第V型CRISPR-Cpf1系统外，基于第2类第VI型CRISPR-Cas13a系统及CRISPR相关转座酶等非常规CRISPR系统的工具与策略也具有巨大的潜力被应用于微生物细胞工厂中。毫无疑问，CRISPR技术将会在高效与智能微生物细胞工厂的构建过程中起到持续的推动作用。

上述研究工作得到了国家自然科学基金（31671845, 31600068, 31930085）、中央高效基本科研专项资金（JUSRP51713B）、国家重点研发计划（2018YFA0900300）、111项目（111-2-06）和江苏省研究生科研创新计划（KYCX18_1802）的资助。

图1期刊封面

图2 CRISPR系统在微生物细胞工厂基因组重构中的应用

图3 CRISPR系统在微生物细胞工厂代谢网络重编程中的应用

图4 CRISPR系统应用于微生物细胞工厂的研究展望