规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统被细菌用来实现对外来遗传元件的适应性免疫，并被设计为基因组编辑的强大工具。基于CRISPR/Cas9的许多基因编辑和调控系统已用于枯草芽孢杆菌，但仍存在多基因编辑的效率较低，调控的实施复杂等缺陷。

江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授团队在Biotechnology and Bioengineering上发表题为CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation system for Bacillus subtilis的文章，创建了CAMERS-B多基因编辑调控系统，实现双基因框内敲除、多位点突变或单基因插入，并开发出多基因转录调控系统，对枯草芽孢杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖和乙偶姻的合成途径进行了改造。

首先通过连续转化Cpf1和CRISPR RNA(crRNA)表达质粒实现基因编辑。设计crRNA插入到pcrF11中，将同源臂和crRNA转化到含Cpf1的菌株中并诱导表达。选择非必需蛋白酶基因aprE、epr、nprE、bpr、mpr和nprB进行多重基因编辑系统验证。使用pHT-XC和pcrF11-1C-DEL敲除单个基因，crRNA靶向aprE和同源臂。然而，将含有靶向epr和nprE的crRNA阵列和相应的同源臂的质粒转化带有pHT-XC的菌株中后，没有发现菌落。将无义突变引入PAMs或crRNA的靶向位点，最多检测到两个基因的点突变。说明枯草芽孢杆菌自身的重组能力不足以同时实现两个基因完全缺失。因此，将突变的钠杆菌(NgAgo)引入pHT-XC中得到pHT-XCR6。NgAgo可以促进同源修复，但无核酸酶活性。pHT-XCR6被用于基因编辑。

图1 CRISPR/Cpf1辅助多基因编辑

使用pcrF11-2C (crRNA阵列靶向epr和nprE)或pcrF11-2C-DEL可以同时敲除两个基因。而将同源臂与crRNA表达质粒共转化，只能敲除一个基因。这表明枯草芽孢杆菌的转化效率较低，不允许使用共转化方法同时删除两个及以上基因。进一步通过双基因连续敲除对迭代基因组编辑进行了测试，pcrF11-2C-DEL和pcrF11-4C-DEL依次对四个基因aprE、epr、nprE和bpr进行了完全敲除。通过Cpf1结合NgAgo引导的重组技术检测多个位点的点突变。使用含有相应crRNA阵列和同源臂的质粒pcrF11-6C-NM可以同时修饰6个基因。使用pcrF11-2C, pcrF11-4C, pcrF11-6C和相应的同源臂可以同时修饰两个基因，用共转化方法也能完成。5%脱脂奶粉平板和sanger测序都证实了这些突变。此外，基因插入时每次只能敲入一个基因。在使用额外的后培养后，这些过程的编辑效率均为100%。

图2 CRISPR/Cpf1辅助多基因无义突变

多基因抑制系统是由木糖诱导的CRISPRi改造而来。将dCpf1和crRNA阵列整合到枯草芽孢杆菌基因组。用于转录抑制的crRNA被设计为靶向目标基因的模板链。在诱导dCpf1表达后，eGFP被强烈抑制。将木糖启动子PxylA替换成IPTG启动子Pgrac100后，抑制作用得到改善，但渗漏的表达变多。在原始Pgrac100的lacO附近增加一个lacO，并将crRNA的Pveg启动子替换为Pgrac100，这样成功降低了泄漏表达，且不影响抑制强度，0.1mM的IPTG即可实现dCpf1的完全诱导。由于dCpf1仍然具有RNA酶活性，再利用设计的crRNA阵列，使用三个组成型表达的荧光蛋白sYFP2、mKate2和mTagBFP2作为指标，实现了多基因抑制。

图3 CRISPR/Cpf1辅助多基因调控

进一步开发转录双控制(同时激活和抑制)系统，10种候选激活蛋白（AbrB, ComA,MalR,ManR,RemA,Spo0A,RpoE,RpoZ,SoxS,P4)分别融合到dCpf1的C端。通过使用组成性表达的荧光蛋白sYFP2, mKate2和mTagBFP2测试上述融合的多基因抑制能力。dCpf1融合RpoZ和AbrB时失去转录抑制功能，剩下8个融合被用于转录激活。以荧光蛋白sYFP2为指示，在转录起始位点上游60~277bp的crRNA上进行表达。融合dCpf1-RemA在位点上游90bp时具有最强的激活强度(对照的1.58倍)。利用设计的crRNA阵列也验证了该融合同时抑制和激活的多个基因的能力。该系统可以作为基于dCas9的转录激活系统的补充。

图4 CRISPR/Cpf1辅助转录双控制系统

最后，利用CRISPR/Cpf1辅助多基因编辑系统，在枯草芽孢杆菌168中重建N-乙酰氨基葡萄糖的生物合成途径。首先将酿酒酵母中乙酰转移酶GNA1基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中，并替换编码GlcN-6-磷酸合酶的glmS的启动子和核酶区，然后在N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢中4个基因(nagA、nagB、nagP和gamA)和副产物合成中2个基因(ldh和pta)中引入无义突变。glmS的过表达使N -乙酰氨基葡萄糖滴度提高了50.9%。阻断分解代谢和副产物合成途径后，最终滴度增加了1.51倍，达到2195mg/L。乙偶姻也是枯草芽孢杆菌的一种天然产物。其分解代谢和副产物合成途径的4个基因(bdhA、acoA、ldh和pta)作为CRISPRi调控靶点。合成通路中alsSD和转录激活因子alsR为CRISPRa的靶点。结果表明，抑制bdhA、acoA、ldh和pta可以使乙偶姻的滴度分别提高14.8%、13.7%、17.9%和7.1%，激活alsSD和alsR使滴度提高9.3%和12.9%。构建靶向bdhA、acoA、ldh、pta和alsR的crRNA芯片，最终使乙偶姻的滴度提高了44.8%，达到25.8g/L。

图5 CAMERS-B介导的代谢工程调控N-乙酰氨基葡萄糖和乙偶姻的合成

该研究开发了一个CRISPR/Cpf1辅助的枯草芽孢杆菌多基因编辑和调控系统。利用SOMACA构建crRNA阵列，使用6种蛋白酶为编辑靶点，可一次实现双基因框内敲除、6个基因点突变或单基因插入，编辑效率为100%。此外，利用融合蛋白和crRNA阵列可以同时抑制和激活不同基因，又重新设计了N-乙酰氨基葡萄糖和乙偶姻的合成途径。该系统具有广泛应用于枯草芽孢杆菌代谢工程的潜力，可用于多种营养品和药物的生产。

相关论文信息：

http://doi.org/10.1002/bit.27322