近日，Nature Chemical Biology在线发表了江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队刘延峰研究员课题组的研究成果“Engineered bacterial orthogonal DNA replication system for continuous evolution” (Nature Chemical Biology,2023,https://www.nature.com/articles/s41589-023-01387-2)。江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室2018级博士田荣臻为论文第一作者，刘延峰研究员为论文通讯作者，陈坚院士、堵国成教授、刘龙教授、李江华教授和吕雪芹副研究员是论文共同作者。

定向进化技术极大地改变了生物酶催化剂的蛋白质工程改造效率。但目前通过在体外建立并筛选突变体文库依然是一项劳动密集型工作，且体外文库构建往往受限于文库大小、DNA长度等。为解决上述难题，该研究首次在原核微生物中建立了正交DNA复制系统，并设计了易错复制的正交DNA聚合酶，实现了体内连续进化（图1a-c）。该系统能够以高于基因组突变率6700倍的速度进化正交线性质粒上的目的基因，且突变包括全部12种碱基替换，进化的目的基因或基因簇可长达15 kb。利用该系统，不仅成功进化出了适用于典型模式微生物大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的强启动子，还通过进化甲醇同化基因簇，大大提高了宿主对甲醇的利用效率。具体内容如下：（1）改造噬菌体GIL16基因组以建立正交复制系统：通过保留温和噬菌体GIL16基因组与复制相关基因，用目的基因替换裂解与结构基因以构建线性质粒（图2a），由于不同的复制机制，线性质粒的复制过程与宿主基因组的复制过程完全正交。线性质粒在宿主中具有很好的稳定性，在没有筛选压力的情况下，70代内几乎没有丢失现象，而表达含相同基因的环形质粒丢失严重（图2e-f）。通过诱导表达正交DNA聚合酶，可以实现线性质粒拷贝数的调控（图2e-f）。（2）理性设计正交DNA聚合酶以获得易错DNA聚合酶：通过结构预测与序列比对，该研究设计了24个正交DNA聚合酶突变体，通过木糖诱导表达突变体，实现了线性质粒复制突变率的提升（图3a-f）。高通量测序结果表明所有突变较为均匀地发生于整个线性质粒，且突变谱包含所有12种碱基突变（图3g-j）。同时，过表达易错正交DNA聚合酶对宿主基因组突变水平无显著影响。（3）体内连续进化获得原核生物强启动子：通过在连续传代过程中诱导易错正交DNA聚合酶的表达，可以在线性质粒上编码的表达元件引入突变。该研究在线性质粒上以P43启动子表达绿色荧光蛋白（GFP），通过连续传代与流式细胞术筛选，最终获得了可以提高36.4倍表达量的启动子PM4（图4a-f）,该启动子在模式微生物大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中也展现出了更高的表达水平（图4g-i）。（4）体内连续进化增加甲醇同化效率：基于正交复制的体内连续进化系统在进化长基因簇时展现出优势。该研究将甲醇同化代谢途径中的5个外源基因插入至线形质粒并进行了连续进化，最终使宿主对甲醇的利用由0.7 g/L提升至8.3 g/L（图5c-f）。上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2018YFA0900300）、国家自然科学基金创新群体项目（32021005）、国家优秀青年科学基金（32222069）、江苏省前沿引领技术基础研究专项项目（BK20202002）和江苏省优秀青年基金（BK20200085）项目的资助。

图1：正交复制系统的建立，设计错配DNA聚合酶实现体内连续进化

图2：改造噬菌体GIL16基因组以建立正交复制系统

图3：理性设计正交DNA聚合酶以获得易错DNA聚合酶

图4：体内连续进化获得原核生物强启动子

图5：体内连续进化增加甲醇同化率