具有双环[3.2.2]壬烷结构的天然产物具有良好的生物活性和应用前景。本课题组前期的研究发现beiticolin 1由一个蒽醌和一个卤代氧杂蒽酮通过特殊的双环[3.2.2]壬烷骨架连接而成（Angew, 2022, 61(37):e202208772）（详见往期推荐1），但是关键酶及其催化机理尚不清楚。本研究发现真菌P450 BTG5在beticolin 1生物合成中负责构建独特的双环[3.2.2]壬烷骨架，且该过程包含二聚化和环化两个步骤。经过蛋白工程改造，发现突变体BTG5-T318A可以实现该两步催化机理的拆分，使催化反应停留在二聚体反应，并可接受系列天然和非天然蒽醌底物与卤代氧杂蒽酮形成二聚体。更重要的是，本研究揭示了BTG5催化的第二步环化反应是罕见P450催化形式氧化还原中性的环化反应，实际包含了氧化和还原两步的过程。以上研究结果更新了P450催化反应的认识范畴，为合成生物学策略创制该类天然产物的复杂性和多样性提供了基础。

首先，作者通过基因敲除发现P450 BTG5可能负责beticolin双环[3.2.2]壬烷骨架的构建，为了验证以上的猜想，在酵母细胞中进行异源重构，发现beticolin的蒽醌部分和卤代氧杂蒽酮部分可以在BTG5催化下构建罕见的双环[3.2.2]壬烷骨架以合成pre-beticolin 1，其在BTG16催化下而形成beticolin 1（图1）。

图1BTG5和BTG16的功能表征

为了揭示其催化机理，利用AlphaFold2模拟其结构模型，并将血红素和底物对接到BTG5模型中，表明底物口袋中残基T318、N319、S391和F393对于BTG5的底物结合和催化反应至关重要，随后尝试通过丙氨酸扫描策略探索BTG5对含双环[3.2.2]壬烷化合物多样性的催化活性，LC-MS结果表明BTG5-T318A突变体可以潜在催化大黄素或大黄酚与卤代氧杂蒽酮发生二聚化反应（图2）。

图2蛋白质工程改造BTG5以探讨其催化混杂性

由于酵母转化效率较低，为了表征潜在产物，在尾孢菌ΔCTB1菌株中用BTG5-T318A代替BTG5构建点突变株，与ΔCTB1菌株和ΔCTB1/ΔBTG5菌株的代谢谱相比，发现了大量的新峰，其中发现大黄素、大黄酚和长蠕孢素的C₁₁甲基被氧化，分别产生了羟基大黄素、芦荟大黄素和羟基长蠕孢素。此外，在低温条件下成功纯化了23d和24d并进行结构表征，结果表明23d是卤代氧杂蒽酮和羟基长蠕孢素的二聚化产物，酵母异源表达实验也验证了这一点；24d则是原始底物卤代氧杂蒽酮和长蠕孢素的二聚化产物（图3）。这表明BTG5-T318不仅可以控制蒽醌部分的底物选择性，还可以调节二聚化或双环[3.2.2]壬烷骨架形成的催化反应。

图3BTG5-T318A催化作用的表征

由于从ΔCTB1/BTG5-T318A菌株中分离到卤代氧杂蒽酮和长蠕孢素的二聚体化合物24a-d，为了进一步研究BTG5的催化机制，纯化的二聚体化合物24d被加入到表达BTG5的酵母中，结果显示产生了pre-beticolin 1（图4A）。这表明，BTG5在双环[3.2.2]壬烷骨架构建中的催化机制涉及一种罕见的两步机制，即二聚化和环化。尽管在其它研究中也有P450催化两步反应的报道，但BTG5的第二环化过程是独特的，它是一个形式上氧化还原-中性的反应，而不是P450常见的氧化过程。为了进一步研究环化机制，使用敲除两个聚酮合酶（ΔCTB1/ΔBTG4）的菌株进行了更深入的研究。结果显示环化反应对氧气的依赖性（Fig 4B）。由于这种形式上氧化还原-中性反应需要氧气，因此还研究了还原剂对环化反应的影响。加入抗坏血酸钠后，反应效率明显提高，证明还原剂在BTG5催化的环化反应中的重要性(图4B)。作者还排除非氧化还原碱介导的Michael加成反应的可能性。综上所述，这表明BTG5催化构建双环[3.2.2]壬烷结构的第二步形式上氧化还原-中性的环化反应涉及一个氧化还原介导的过程，而这一过程从未被报道过。

图4BTG5催化异源二聚体构建双环[3.2.2]壬烷骨架的机制研究

综上所述，作者提出了BTG5构建罕见双环[3.2.2]壬烷结构的催化机理（图5）。

图5BTG5构建双环[3.2.2]壬烷骨架的催化机理

上述工作在线发表于J Am Chem Soc(https://doi.org/10.1021/jacs.4c01284)，实验室饶义剑教授为该论文的通讯作者，博士生许会宾、袁振波副研究员和硕士生杨赛为该论文的共同第一作者。上述研究工作得到了国家重点研发计划(2018YFA0901700)，国家自然科学基金项目(32270082)，江苏省自然科学基金(BK20202002)和江苏省研究生科研创新计划(KYCX20_1816)等基金资助。

近年来饶义剑教授团队围绕“复杂天然产物（药物）的生物合成途径解析和仿生定向合成”开展了系统性的研究，并取得了一系列原创性研究成果，部分成果已发表在J Am Chem Soc(2024)、Nature Commun(2023, 2024)、Angew(2022, 2023, 2024)、ACS Catalysis(2020, 2021, 2022, 2024)、Green Chem(2019, 2022)、Water Research(2022)、J Hazar Mater(2021, 2023)、Chem Eng J(2021)等本领域权威期刊。