近日，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室中西秀树教授团队高晓冬课题组在关于真核细胞N-糖基化修饰的基础研究中取得进展，研究成果“Rft1 catalyzes lipid-linked oligosaccharide translocation across the ER membrane”在线发表于Nature Communications。

天冬酰胺(N)-连接的糖基化是真核细胞蛋白质重要的翻译后修饰方式之一，约90%的糖蛋白被N-糖基化修饰。N-糖基化修饰始于内质网（ER）膜上多萜醇寡糖前体（DLO）的装配，首先在ER膜的外侧通过一系列特定的糖基转移酶（Alg）将2个N-乙酰葡萄糖胺（GN）和5个甘露糖（M）依次添加至多萜醇磷酸（Dol-P），形成M5GN2-PP-Dol。随后，M5GN2-PP-Dol通过磷脂双分子层翻转至ER内腔，这种跨膜转运是快速的、不依赖ATP、对蛋白酶敏感，并且具有极高的底物特异性。转运在热力学上是不利的，因为极性的糖基头部必须穿过脂双层的疏水内部。Helenius和Aebi在二十年前报道Rft1可能参与了该过程。然而，迄今为止，糖生物学界对Rft1翻转酶的身份仍存在很大争议。作者通过高拷贝抑制子筛选到了古菌HhAgl23可以回补rft1Δ细胞的致死性状和N-糖基化缺陷。此外，作者还开发了一个体外LLO翻转酶测定法，利用蛋白脂质体和纯化的Rft1或HhAgl23蛋白中确认了M5GN2-PP-Dol的翻转活性。最终确认Rft1翻转M5GN2-PP-Dol的功能。

首先，作者根据序列相似性进行预测，将HsRFT1（人）、TbRFT1（布氏锥虫）、HhRFT1（西班牙盐辉菌）、HvRFT1（火山盐古菌）、HsCLPTM1L（人）和Thermosipho africanus MurJ（细菌），它可以转运与脂质连接的肽聚糖前体以及古生物H. hispanica Agl 23（HhAgl23）转入到rft1Δ酵母菌中，只有HhAgl23能够抑制rft1Δ致死性状。这表明HhAgl23是酵母rft1Δ的真正功能性抑制子（图1）。

▲图1 RFT1缺陷高拷贝抑制子的筛选

为了进一步验证HhAgl23和Rft1在LLO转运过程中的功能，作者建立了一种用于检测M5GN2-PP-Dol翻转活性的体外测定法。利用鸡蛋磷脂酰胆碱（PC）和脑磷脂酰丝氨酸（PS）生成的脂质体，并含有合成的植物醇丁烷基焦磷酸盐M5GN2（M5GN2-PP-Phy）底物。在这些脂质体中，M5GN2-PP-Phy在内外膜层之间呈随机分布，大约一半的寡糖面对腔内，另一半面对外部。外部的α1,2连接的甘露糖应该可以被甘露糖苷酶切割，而腔内的甘露糖是不可接近的，因此受到保护而不受切割。在α1，2甘露糖苷酶存在或不存在的情况下对脂质体进行的UPLC-MS分析证实，该处理导致了M5GN2预测转化为M3GN2，其中M3GN2占寡糖的50%。为了确定Rft1或HhAgl23是否催化M5GN2-PP-Phy的转位，我们试图在不含ATP的反应中，利用纯化的ScRft1或HhAgl23重组脂质体，并用α1，2甘露糖苷酶进行处理。包含ScRft1或HhAgl23的蛋白质脂质体中的M5GN2与M3GN2的比值减少。不含蛋白质的脂质体或含有与之并行纯化的非相关蛋白质（H. hispanica，HhAgl22）的蛋白质脂质体在1小时时间点后维持了大约50%的M5GN2与M3GN2的稳定比率（图2）。实验表明，无论是Rft1还是古生物HhAgl23都能够在体外催化M5GN2-PP-Phy的转位。

▲图2 Rft1和HhAgl23体外翻转酶

LLO生物合成途径中胞质定位的甘露糖基化步骤包括M1、M2、M3、M4和M5GN2-PP-Dol中间体的逐步合成。M5GN2-PP-Dol的两个关键属性是其ER定位和与其他LLO中间体相比，其对胞质M5GN2-PP-Dol的优先识别。为了测试ScRft1的底物特异性，作者在含有M3GN2-PP-Phy作为底物的脂质体中测定了其翻转酶活性。为了测定这些含有M3GN2-PP-Phy的脂质体，作者使用α1-2,3甘露糖苷酶将M3GN2转化为M2GN2作为定量转位的读数。在存在或不存在α1-2,3甘露糖苷酶的情况下，对这些脂质体制备的寡糖进行的UPLC-MS分析表明，这种处理导致了M3GN2到M2GN2的预期转化，其中M2GN2占寡糖的50%。重新组装了纯化的ScRft1的蛋白质脂质体显示M3GN2到M2GN2比率没有下降，在经过4小时孵育后，仍有50%的M3GN2保留。相反，在含有HhAgl23的蛋白质脂质体中，少于15%的M3GN2保留，验证了HhAgl23的M3GN2-PP-Dol翻转活性。这些结果表明，与HhAgl23不同，ScRft1可以更有效地跨膜转位M5GN2-PP-Phy，而不是M3GN2-PP-Phy，表明其对M5GN2胞质LLO中间体具有很强的偏好性（图3）。

▲图3 Rft1底物偏好性分析

以上工作得到了国家自然科学基金（31971216，32271342）、轻工业技术与工程国家一级学科计划（LITE2018-015）、山东省重大科技创新项目（2019JZZY011006）等的支持。