硕士研究生：张景景（2018年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：徐美娟副教授

专业：微生物学

论文题目：钝齿棒杆菌N-乙酰谷氨酸激酶分子改造及其在L-精氨酸合成中的应用

摘要：N-乙酰谷氨酸激酶是钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）SYPA5-5合成L-精氨酸途径中的关键限速酶，受到终产物L-精氨酸的反馈抑制。本研究以来源于钝齿棒杆菌SYPA5-5的N-乙酰谷氨酸激酶（CcNAGK）为研究对象，通过饱和突变和定点突变对其进行分子改造，解析反馈抑制机理并进行催化性能的研究；在此基础上，获得既能解除产物反馈抑制又提高酶的催化活性和热稳定性的优良突变体，应用突变体提高了L-精氨酸的产量。主要研究内容如下：（1）基于CcNAGK三维结构并结合分子对接分析，首先对其L-精氨酸结合域的关键位点E19进行饱和突变，根据半抑制常数的变化规律和精氨酸结合位点结构的变化来解析反馈抑制解除机理。结果表明CcNAGK精氨酸结合域入口处E19位点决定了L-精氨酸能否进入Arginine-ring；19位点所带负电荷对于精氨酸的结合至关重要，反馈抑制解除的效果与19位残基负电荷和侧链大小及形状有关；其中，突变体E19F、E19W与E19Y的I0.5R值比野生酶CcNAGK（I0.5R=0.39 mmol）提高了约380倍；解除了L-精氨酸对其的反馈抑制作用。为了验证最佳突变体E19Y在胞内对于解除精氨酸的抑制是否有效，将突变基因argBE19Y在C.crenatumSYPA5-5中过量表达，并将重组菌SYPA-E19Y进行5 L上罐发酵96 h，L-精氨酸的产量为55.3 g·L^-1，比原始菌提高27.9%。（2）对CcNAGK活性中心关键位点G71、I74、F91进行饱和突变，根据其底物结合位点结构分析与动力学参数的测定，进行催化性能的研究。发现CcNAGK的催化活性与稳定性不仅与底物结合位点残基的大小、形状，极性与非极性，氢键的形成以及是否带电荷有关，还与芳香族性质，疏水作用以及活性中心的构象有关。从饱和突变文库中获得了三个催化效率与热稳定性显著提高的突变体I74V、F91Y和F91H,其比酶活分别提高38%，41%和52%，并且在30℃下的半衰期由野生型的37 h分别延伸至73 h，86 h和102 h。（3）为进一步提高CcNAGK的性能，将处于α-螺旋与β-折叠的转角处位点K234，根据同源多序列比对对该点定点突变，获得了显著提高热稳定性的突变体K234N与K234T，其中突变体K234T在30℃下的半衰期可延长至108 h。（4）将位点E19Y和位点I74V、F91H、K234T进行组合突变，获得既能解除产物反馈抑制又显著提高其催化活性及热稳定性的优良突变体NAGKEH3，其半抑制常数提高382倍，催化活性提高1.73倍，在30℃下的半衰期延长至118 h。为了考察在解除L-精氨酸反馈抑制的基础上提高CcNAGK的催化活性和热稳定性对精氨酸合成的影响，将组合突变基因argBEH3通过表达质粒pDXW-10在C.crenatumSYPA5-5中过量表达，构建重组菌株C.crenatumSYPA-EH3，并在5 L发酵罐中培养96 h，最终使得L-精氨酸产量可达61.2 g·L^-1，比原始菌提高41.8%。

关键词：钝齿棒杆菌；N-乙酰谷氨酸激酶；理性突变；酶学性质；L-精氨酸