硕士研究生：杨彬（2019年江苏省优秀硕士学术学位论文）

导师：刘立明教授

专业：发酵工程

论文题目：构象动力学方法改造酶性能以生产医药中间体

摘要：生物催化凭借其环保、高效等优点，广泛应用于生产医药中间体。在这一过程中,生物催化剂（酶）性能是生物催化过程的关键，其活性、选择性、稳定性和底物耐受性的高低将直接影响到催化效率，关系到将来能否实现大规模产业化应用。因此，广泛应用蛋白质工程改造策略改善酶的特性。构象动力学工程，就是基于对酶的构象动力学分析所开发的新技术手段，已成为蛋白质进化的有效策略，在降低产物抑制和酶的理性设计等方面取得了显著效果。本论文建立了构象动力学工程方法，并介绍了其在提高南极假丝酵母脂肪酶B (CALB, EC 3.1.1.3)对映体选择性生产(R)-3-叔丁基二甲硅氧基(TBDMSO)戊二酸单甲酯和降低L-氨基酸脱氨酶(L-AAD, EC 1.4.3.2)产物抑制生产苯丙酮酸(PPA)工艺中的应用。主要研究如下：1.构象动力学工程方法的建立。通过分析酶的构象在酶催化过程中发挥重要作用，引出基于构象动力学的酶分子改造策略；建立了构象动力学工程方法进行酶改造的流程：获取酶的三维结构、分子对接、选择拟突变氨基酸位点、分子动力学模拟设计最佳突变体、突变体的评价；根据实验需求，选择了同源建模软件Swiss-model、分子对接软件Autodock Vina、分子动力学模拟软件GROMACS 4.5.5等，并将其移植到超级计算机“神威·太湖之光”计算系统,完成了构象动力学工程方法模拟平台的搭建。2.构象动力学工程方法提高CALB的对映体选择性。通过结构分析和分子动力学模拟，对CALB结合口袋周围loop结构上的候选氨基酸进行模拟丙氨酸扫描筛选，确定了关键位点A281和D223；在该位点进行模拟饱和突变，根据酶的结合口袋构象动力学变化(RMSF)，设计得到最佳突变体M₀(A281S/D223V)；M₀的活性口袋和通道处的结构束缚增强，催化关键氨基酸与R-产物的距离减小，与S-产物的距离变大，与两种产物的结合能之差从3.86 kJ·mol^-1增加到17.49 kJ·mol^-1；S-产物的初始合成速率(V_S)急剧下降，R-产物的初始合成速率(V_R)略有降低，V_R/V_S值从1.17提高至200.11，30℃下的对映体选择性从8.00%提高至99.00%，突变酶的动力学参数变化与对映体选择性变化一致。突变体M₀经过条件优化，在初始葡萄糖浓度为25 g·L^-1的培养基中培养,利用葡萄糖为诱导剂，在28℃诱导48 h酶活力最高达15000 U·mL^-1；酶液与载体以25:1 (v:w)的比例，在37℃条件下固定化5 h，用pH为8的缓冲液清洗后冻干，固定化酶活力最高为2500 U·g^-1；将80 g·L^-1的固定化酶和60 g·L^-1底物在30℃下转化12 h，(R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯R-ee值为99.00%,时空产率为107.54 g·L^-1·d^-1。3.构象动力学工程方法降低PPA对L-AAD的产物抑制。通过对酶结构分析，确定产物PPA周围loop结构上的候选氨基酸位点；根据构象动力学工程原理，在候选氨基酸位点处引入突变，构建单突变体，完成丙氨酸扫描，获得PPA产量提高的单突变体T105A、E145A、S412A、E340A、E417A，其中，T105A产量最高达47.18 g·L^-1；将上述单突变体进行组合，筛选获得PPA产量进一步提高的五点组合突变体M₅(T105A/E145A/S412A/E340A/E417A)，PPA产量达到69.50 g·L^-1，比野生型产量提高约70%；突变体M₅的产物抑制常数K_PI从22.80±0.9 g·L^-1增大到84.40±2.2 g·L^-1，动力学参数kcat值比野生型增加了2倍，催化效率(kcat/K_M)是野生型的1.6倍。运用计算机模拟分析突变体M₅的构象动力学变化，发现突变引起通道处两个Flap结构的RMSF值变大。经过条件优化，突变体M₅在TB培养基中培养至OD 0.8，添加乳糖(5 g·L^-1)在25℃下诱导12 h，酶活力最高为50 U·g^-1；30 g·L^-1的湿菌体和75 g·L^-1；1 L-苯丙氨酸在30℃、pH 7.5的条件下转化12 h，PPA的产量最高为72.50 g·L^-1，转化率96.67%。

关键词：构象动力学工程；南极假丝酵母脂肪酶B；L-氨基酸脱氨酶；对映体选择性；产物抑制；(R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯；苯丙酮酸