博士研究生：田荣臻（2023年江苏省优秀博士学术学位论文）

导师：陈坚教授

专业：发酵工程

论文题目：高效合成N-乙酰神经氨酸枯草芽孢杆菌底盘细胞的设计与构建

摘要：N-乙酰神经氨酸(Neu Ac)，又称燕窝酸或唾液酸,是哺乳动物中发现的唾液酸类化合物中最主要的一种,对于改善大脑发育和认知、增强免疫功能等具有重要作用，已被广泛用作营养化学品和药物中间体。同时，以Neu Ac为合成前体的多种化合物,特别是唾液酸基母乳寡糖,在营养强化剂领域有重要应用。目前，Neu Ac的工业化生产方法主要为提取法和全细胞催化法,存在成本高、污染环境和引入过敏原等固有缺陷。因此开发高效合成平台化合物Neu Ac的微生物底盘细胞对于各类以Neu Ac为合成前体的多种化合物高效生物合成方法的拓展具有重要意义。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为一种食品安全微生物，通过代谢工程改造能够高效合成Neu Ac前体N-乙酰氨基葡萄糖(Glc NAc)，是适合进行Neu Ac高效合成的底盘细胞。本课题以本研究室构建的一株产Neu Ac枯草芽孢杆菌B6CG作为出发菌株,通过基因表达工具箱的完善、限速步骤的解析与消除、生长生产的平衡调控与合成途径的替换优化四个方面，开展高效合成Neu Ac枯草芽孢杆菌底盘细胞的构建。主要研究内容如下：(1)通过枯草芽孢杆菌转录组与蛋白组数据分析，获得潜在594个不同强度N-端编码序列(NCS)。从中选取96个，使用绿色荧光蛋白(GFP)表达水平进行验证，初步获得了荧光强度跨越4个数量级的NCS文库，使GFP表达水平在使用强启动子P43的基础上提高至6.95倍。根据添加不同NCS后荧光强度曲线变化特征，将NCS分为生长偶联型、迟滞表达型、持续表达型和强烈抑制型。通过统计学分析发现,目前已经提出的五种机制：N端规则、m RNA二级结构、热力学和动力学、A-T含量和带电荷的氨基酸含量都难以用于预测和设计NCS。通过分析发现特定氨基酸的丰度与蛋白表达水平显著相关，因此对NCS进行了理性设计，使GFP表达水平在使用强启动子P43的基础上提高至8.47倍，实现了通过理性改造上调或下调目的基因表达水平。为了实现NCS的自动高效设计，开发了网站用于NCS的自动设计(http://www.wjiangnan.com/dna/)。(2)分别使用天然NCS与人工设计NCS强化强启动子Plyt R调控的关键酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰基转移酶(GNA1)的表达，使Neu Ac产量从0.8 g/L提升至2.0 g/L。然后基于Michaelis-Menten方程与Neu Ac代谢途径,构建了由底物葡萄糖合成目标产物Neu Ac的动力学模型，共包含13步酶促反应和26个酶促反应动力学参数。通过动态模拟，分析获得Neu Ac合成途径中的两个潜在关键限速靶点是6-磷酸果糖激酶(Pfk A)和丙酮酸激酶(Pyk)。为了快速验证限速步骤，通过在无细胞合成体系中外源添加不同中间代谢产物，发现当添加磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时，Neu Ac产量从0.3 g/L显著提升至0.6 g/L，验证了动力学模型预测结果。因此，利用NCS对关键基因pfk A与pyk进行表达下调与动态表达调控，Neu Ac产量提高了80.0%，达到3.6 g/L。(3)针对Neu Ac合成底盘细胞生长与产物合成之间不平衡的问题，在枯草芽孢杆菌中构建了密码子扩展技术，通过表达非天然氨基酸氨酰t RNA合成酶和t RNA突变体(Mut RNA)，实现了基因表达的翻译过程中对于TAG终止密码子的识别和非天然氨基酸(O-甲基酪氨酸,OMe Y)的掺入。通过Mut RNA启动子突变文库高通量分选、拷贝数优化与合成启动子测试，构建了基于添加非天然氨基酸的基因表达精准调控工具，可实现基因表达80倍激活。利用OMe Y的添加分别控制枯草芽孢杆菌细胞生长关键酶UDP-N-乙酰基丙酮酰氨基葡萄糖还原酶(Mur B)、双组分系统调节蛋白(Wal R)和磷脂酸胞苷转移酶(Cds A)的表达，实现了重组菌株细胞生长的精确调控，最优细胞生长与产物合成平衡条件下Neu Ac产量提高33.3%,达到4.8 g/L。同时,使用密码子扩展获得的底盘细胞不添加OMe Y时，逃逸率低于3.67×10^-10(escapees/c.f.u.)，避免了重组菌株在自然界中繁殖，实现了重组菌株高效生物封存(Biocontainment)。(4)针对中间代谢物N-乙酰氨基葡萄糖(Glc NAc)与N-乙酰甘露糖(Man NAc)大量积累的问题，首先重构并优化了无Glc NAc生成的UDP-Glc NAc差向异构酶(Neu C)途径，并对Neu Ac合成直接前体物质UDP-Glc NAc合成的关键酶谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基转移酶(Glm S)、磷酸氨基葡萄糖变位酶(Glm M)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(Glm U)使用不同强度启动子进行优化，消除了中间代谢物Glc NAc,使Neu Ac产量提升96.7%至5.9 g/L。其次，为了降低中间代谢物Man NAc的积累，通过N-乙酰神经氨酸合酶(Neu B)定向进化、不同来源Neu B共表达与PEP供给强化,Man NAc降低46.3%，从4.1 g/L降至2.2 g/L,同时Neu Ac产量提升54.9%,至7.9 g/L。最后，使用本文建立的基于密码子扩展的方法，进行细胞生长与产物合成的平衡调控，在3 L发酵罐补料分批发酵中Neu Ac最大产量为21.8 g/L，得率为0.04 g/g葡萄糖，生产强度为0.34 g/L/h，且生产强度达到目前报道最高水平。

关键词：枯草芽孢杆菌；N-乙酰神经氨酸；N-端编码序列；密码子扩展；细胞生长调控；合成生物学；合成途径重构

博士研究生：丁强（2023年江苏省优秀博士学术学位论文）

导师：刘立明教授

专业：发酵工程

论文题目：调控微生物形态提高合成能力的研究

摘要：微生物细胞工厂提供了一条经济、环保的方式利用可再生资源为原料，借助微生物的生产能力，提高工业化学品的生产性能。然而，工业化学品的生产性能受到微生物合成能力的影响。因此，如何进一步提高微生物的合成能力是目前生产工业化学品面临的重大挑战。为此，本论文以Aspergillus oryzae(A.oryzae)和Escherichia coli(E.coli)为研究模型，以调控细胞形态提高微生物合成能力为出发点，借助微生物生理机制与合成生物学技术手段，发展提高比表面积、增大细胞体积和扩大接触面的调控策略，实现A.oryzae和E.coli形态的理性设计与动态调控，提高工业化学品的合成能力。主要研究结果如下：1.提高A.oryzae的比表面积提升L-苹果酸的合成能力：通过ARTP、60Co-γ和DES对A.oryzae进行诱变，提高A.oryzae的菌落直径和孢子比表面积，获得A.oryzaeFMME218-37；通过分析A.oryzaeFMME218-37与野生型的生理学参数差异，优化C/N比例提高菌落直径和孢子比表面积改善L-苹果酸生产。最终，A.oryzaeFMME218-37在7.5-L生物反应器中发酵168 h，L-苹果酸的产量、得率和生产强度分别达到95.20 g/L、0.54 g/g和0.57 g/L/h，分别比出发菌株提高16.01%、217.24%和35.19%；2.增加E.coli的比表面积提高乙偶姻的合成能力:通过过表达缩短E.coli细胞分裂C和D阶段的fts ZA和nrd AB基因，提高E.coli的比表面积;基于光敏蛋白EL222和信号分子C-di-GMP分别构建蓝光激活工具和近红外光激活工具，组装形成蓝光激活和近红外光激活系统；通过蓝光激活和近红外光激活系统(BANA)提高比表面积改善乙偶姻生产。最终,E.coliDN4在5-L生物反应器中发酵72 h，乙偶姻的产量、得率和生产强度分别达到67.20 g/L、0.47 g/g和0.93 g/L/h，分别比出发菌株提高39.19%、23.56%和39.19%;3.增大E.coli的细胞体积提高聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)的合成能力：通过表达延长E.coli细胞分裂C和D阶段的nrd A和sul A基因，提高E.coli的细胞体积；基于光敏蛋白的结合位点构建蓝光抑制工具，组装成蓝光激活抑制和近红外光激活系统；通过蓝光激活-抑制和近红外光激活系统(BARNA)增大细胞体积改善聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)生产。最终，E.coliDQ8在5-L生物反应器中发酵84 h，聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)产量、含量和生产强度分别达到14.31 g/L、53.8 wt%和0.17 g/L/h，分别比出发菌株提高137.71%、100.97%和137.71%；4.扩大E.coli对底物的接触面提高莽草酸和L-苹果酸的合成能力：通过Spytag-Spy Catcher固定蛋白与生物被膜基因csg A融合，构建Spytag-Spy Catcher共价固定系统；利用Spytag-Spy Catcher共价固定系统扩大E.coli对淀粉的接触面改善莽草酸生产。因此，E.coliS6在3.6-L生物反应器中发酵96 h，莽草酸产量和得率分别达到50.96g/L和0.33 g/g，分别比出发菌株提高62.81%和30.12%；通过苯酚功能化修饰纳米材料Cd S和生物被膜,构建Cd S-生物杂合系统；利用Cd S-生物杂合系统扩大E.coli对Cd S的接触面改善L-苹果酸生产。最终,E.coliM6在3.6-L生物反应器中发酵78 h，L-苹果酸的产量、得率和生产强度分别达到45.93 g/L、0.72 g/g和0.59 g/L/h,分别比出发菌株提高56.76%、31.25%和56.76%。

关键词：微生物形态；合成能力；比表面积；细胞体积；接触面